کاربرد نانوساختارهای مگنتیک کیتوزان در تثبیت آنزیم آلفاآمیلاز باکتریایی

افریشم, سعیده; بدویی ذلفارد, ارسطو; عطایی, سید احمد; محمدی پور, شیرین

doi:10.22034/jahid.2025.2055099.1056

کاربرد نانوساختارهای مگنتیک کیتوزان در تثبیت آنزیم آلفاآمیلاز باکتریایی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

سعیده افریشم ¹

ارسطو بدویی ذلفارد ²

سید احمد عطایی ³

شیرین محمدی پور ⁴

¹ گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران.

² گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

³ بخش مهندسی شیمی، دانشکده فنی و مهندسی، دانشگاه شهید باهنر کرمان

⁴ گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

10.22034/jahid.2025.2055099.1056

چکیده

آلفا-آمیلازها متعلق به خانواده‌ی اندوآمیلازها می‌باشند که هیدرولیز اولیه‌ی نشاسته به اولیگوساکاریدهای کوچکتر را با شکست پیوند (4→1)α انجام می‌دهند. در بین انواع مختلف آنزیم‌ها، آلفاآمیلازها گروه مهمی با کاربردهای گسترده در صنایع مختلف را تشکیل می دهند. استفاده از اآنزیم‌ آزاد در صنایع مختلف محدودیت‌هایی دارد از جمله: هزینه بالا، پایداری کمتر، قابلیت استفاده مجدد ضعیف و مشکل در استفاده از آنها در راکتورهای مداوم. این محدودیت ها با تثبیت آنزیم به حداقل خواهد رسید. تثبیت آنزیم بر روی بسترهای مختلف قابل انجام است. در این میان تثبیت آنزیم بر روی سطوح نانو به ویژه نانو ذرات مغناطیسی به دلیل سمیت کم آن‎ها، قابلیت استفاده مجدد آنزیم همراه با افزایش پایداری و عملکرد مقاوم آن در شرایط مختلف بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در این پژوهش، تثبیت آنزیم آلفاآمیلاز با استفاده از نانوذرات Fe2o3 بر روی بستری از پلیمر کیتوزان انجام گرفت. به منظور تولید اولیه ی آنزیم، کشت شبانه ی باسیلوس موجاونسیس به محیط مایع اختصاصی تلقیح و به مدت 48 ساعت انکوبه گردید. آنزیم به دست آمده با استفاده از آمونیوم سولفات تغلیظ و سپس دیالیز شد. آنزیم دیالیز شده در حضور گلوتارآلدهید 50 درصد (اتصال دهنده ) به نانوذرات Fe2o3 در بستر کیتوزان اتصال داده شد. فعالیت و پایداری آنزیم تثبیت شده با نانوذرات در 540 نامتر اندازه گیری و مشخص گردید که به ترتیب 53 و 48 درصد نسبت به آنزیم آزاد افزایش داشته است. هم چنین غلظت آنزیم تثبیت شده با استفاده از نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی 25 میکروگرم تخمین زده شد.

کلیدواژه‌ها

آلفاآمیلاز

تثبیت

نانوذرات مغناطیسی

کیتوزان

فعالیت

موضوعات

عنوان مقاله English

Application of magnetic chitosan nanostructures in immobilization of bacterial alpha-amylase enzyme

نویسندگان English

Saideh Afrisham ¹

Arastoo Badoei-Dalfard ²

Seyed ahmad Ataei ³

Shirin Mohammadipour ⁴

¹ Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

² Department of Biology, Faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran

³ Department of Chemical Engineering, Faculty of Technology and Engineering, Shahid Bahonar University of Kerman

⁴ Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran.

چکیده English

Alpha-amylases belong to the endoamylase family, which perform the primary hydrolysis of starch to smaller oligosaccharides by breaking the (4→1)α bond. Among the different types of enzymes, alpha-amylases constitute an important group with wide applications in various industries. The use of free enzymes in various industries has limitations, including: high cost, lower stability, poor reusability, and difficulty in using them in continuous reactors. These limitations can be minimized by immobilizing the enzyme. Enzyme immobilization can be performed on various substrates. In the meantime, enzyme immobilization on nano-surfaces, especially magnetic nanoparticles, has received much attention due to their low toxicity, reusability of the enzyme along with increased stability and robust performance under various conditions. In this study, alpha-amylase enzyme immobilization was performed using Fe2O3 nanoparticles on a chitosan polymer substrate. For the initial production of the enzyme, an overnight culture of Bacillus mujavensis was inoculated into a specific liquid medium and incubated for 48 hours. The obtained enzyme was concentrated using ammonium sulfate and then dialyzed. The dialyzed enzyme was bound to Fe2O3 nanoparticles in a chitosan substrate in the presence of 50% glutaraldehyde (binding agent). The activity and stability of the enzyme immobilized with nanoparticles were measured at 540 nm and were found to be 53 and 48% higher than the free enzyme, respectively. The concentration of the immobilized enzyme was also estimated using a standard curve of 25 μg bovine serum albumin.

کلیدواژه‌ها English

Alpha-amylase

immobilization

magnetic nanoparticles

chitosan

activity

1. R. A. Sheldon, Chirotechnology: Industrial Synthesis of Optically Active Compounds, Marcel Dekker, New York, 1993.

2. M.G. Bellino, A.E. Regazzoni, Amylase-functionalized mesoporous silica thin films as robust biocatalyst platforms, Appl. Mater. Interfaces.2 (2010) 360-365.

3. P.Tripathi, A. Kumari, P. Rath, A.M. Kayastha, Immobilization of α-amylase from mung beans on

Amberlite MB 150 and chitosan beads: A comparative study, J.Mol.Catal.B:Enzym. 49 (2007) 69-7.

4. N. Jaiswal, O.Prakash, M. Talat, S.H. Hasan, R.K. Pandey, α-Amylase immobilizati on on gelatin:

Optimization of process variables, J. Genet. Eng. Biotechnol. 10 (2012)161-167.

5. D.Tanyolac, B.I.Yuruksoy, A. R. Ozdural, Immobilization of a thermostable α-amylase, termamyl, onto nitrocellulose membrane by Cibacron Blue F3GA dye binding, Biochem.Eng. J. 2(1998) 179-186.

6. Y. Liu, S. Jia, Q. Wu, J. Ran, W. Zhang, S. Wu, Studies of Fe3O4-Chitosan nanoparticles prepared by co-precipitation under the magnetic field for lipase immobilization, Catal Commun. 12 (2011) 717-720.

7. Huang Y, Wang Y, Wang Y, Pan Q, Ding X, Xu K, Li N and Wen Q 2016 Ionic liquid-coated Fe3O4 /APTES/graphene oxide nanocomposites: synthesis, characterization and evaluation in protein extraction processes RSC Adv. 6 5718–28.

8. Liu Y, Li Y, Li X-M and He T 2013 Kinetics of (3-Aminopropyl) triethoxylsilane (APTES) Silanization of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Langmuir 29

9. Zhang Y, Kohler N and Zhang M 2002 Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake Biomaterials 23 1553–61.

10. Gawande M B, Monga Y, Zboril R and Sharma R K 2015 Silica-decorated magnetic nanocomposites for catalytic applications Coord. Chem. Rev. 288 118–43.

11. Khor E 2002 Chitin: a biomaterial in waiting Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 6 313–7.

12. Kubota N and Shimoda K 2004 Macromolecular Complexes of Chitosan Polysaccharides (CRC Press) pp 679–706.

13. Petkova G A, Záruba К, Žvátora P and Král V 2012 Gold and silver nanoparticles for biomolecule immobilization and enzymatic catalysis Nanoscale Res. Lett. 7 287.

14. Hii S L, Tan J S, Ling T C and Ariff A Bin 2012 Pullulanase: Role in Starch Hydrolysis and Potential Industrial Applications Enzyme Res. 2012 1–14.

15. Hashemabadi M, Badoei-Dalfard A. Fabrication of Magnetic CLEA-protease Nanocomposite: High Progression in Biotechnology and Protein Waste Management. Catalysis Letters. 2019 Jul 1;149(7):1753-64.

16. Bernfeld, P. (1955). [17] Amylases, α and β. Methods in Enzymology, 1, 149-158.

17. Karakaş, B., İnan, M. & Certel, M. (2010). Expression and characterization of Bacillus subtilis PY22 alpha-amylase in Pichia pastoris. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 64(3), 129-134.

18. Dhavale RP, Parit SB, Sahoo SC, Kollu P, Patil PS, Patil PB, Chougale AD. α-amylase immobilized on magnetic nanoparticles: reusable robust nano-biocatalyst for starch hydrolysis. Materials Research Express. 2018 Jul 4;5(7):075403.

19. Sohrabi N, Rasouli N, Torkzadeh M. Enhanced stability and catalytic activity of immobilized α-amylase on modified Fe3O4 nanoparticles. Chemical Engineering Journal. 2013; 11.059.

20. El‐Ghaffar MA, Hashem MS. Immobilization of α‐amylase onto chitosan and its amino acid condensation adducts. Journal of applied polymer science. 2009 Apr 15;112(2):805-14.

21. Tripathi P, Kumari A, Rath P, Kayastha AM. Immobilization of α-amylase from mung beans (Vigna radiata) on Amberlite MB 150 and chitosan beads: A comparative study. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2007 Nov 16;49(1-4):69-74.

22. Kumari A, Kayastha AM. Immobilization of soybean (Glycine max) α-amylase onto Chitosan and Amberlite MB-150 beads: optimization and characterization. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2011 Apr 1;69(1-2):8-14.

23. Yang K, Xu NS, Su WW. Co-immobilized enzymes in magnetic chitosan beads for improved hydrolysis of macromolecular substrates under a time-varying magnetic field. Journal of biotechnology. 2010 Jul 20;148(2-3):119-27.